Autentificare
Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta
Căutare:
Căutare:
Acasă  »  EDUCAȚIE  »  Ars Medici

Electroporarea terapeutică

Viața Medicală
Biol. Lucia E. IONESCU marţi, 14 iunie 2016
Viața Medicală
Prof. dr. Viorel ORDEANU marţi, 14 iunie 2016
     Medicina modernă caută în permanență noi tehnologii aplicabile în diagnosticul, profilaxia și tratamentul bolilor. Între acestea, aplicațiile biologiei moleculare reprezintă o direcție de viitor, în special în tratamentul bolilor considerate în prezent incurabile. Medicina translațională aplică noile descoperiri din cercetările de biologie celulară, moleculară și genetică, precum și tehnicile rezultate din acestea, pentru terapeutica bazată pe biologie, care înlocuiește treptat terapeutica bazată pe chimie. De exemplu, prin aplicarea curentului electric la nivel celular se pot introduce țintit molecule terapeutice în celulele bolnave sau se poate realiza transfecție de material genetic.
     Electroporarea este electropermeabilizarea membranelor celulare, care constă în creșterea conductivității electrice și a permeabilității membranei plasmatice a celulelor, fiind determinată de aplicarea unui câmp electric extern. Această procedură este utilizată în special în biologia moleculară, cu scopul de a introduce anumite substanțe într-o celulă (o sondă moleculară sau un medicament), care pot induce modificări ale funcțiilor celulare sau de codificare ADN (1).
     Electroporarea este un fenomen dinamic, care depinde de voltajul transmembranar local pentru fiecare punct de la nivelul membranei celulare. În funcție de tipul și durata impulsului, pragul tensiunii transmembranare permite manifestarea fenomenului de electroporare. Valoarea-prag a magnitudinii câmpului electric necesar pentru realizarea fenomenului de electroporare este cuprinsă între 0,5 și 1 V. Numai celulele aflate în câmp electric mai mare decât valoarea-prag pot fi electroporate. Dacă este atins sau depășit un al doilea prag, electroporarea va compromite viabilitatea celulelor, fenomen numit electroporare ireversibilă (2).
     În biologia moleculară, procesul de electroporare poate fi folosit pentru transformarea celulelor procariote (bacterii) și eucariote (levuri și protoplaste). Bacteriile care prezintă perete celular alcătuit din peptidoglicani cu rol de protecție, rezistență și transport al substanțelor sunt protejate de modificările mediului înconjurător. Pe baza acestei proprietăți, punerea în contact a bacteriilor cu anumite plasmide poate avea ca efect transferarea plasmidului în celule bacteriene în urma unui proces de electroporare, prin aplicarea câtorva sute de volți pe o distanță de câțiva milimetri. Ulterior, celulele trebuie manipulate cu grijă până când se vor divide în noi celule care să conțină noile plasmide, acest proces fiind de aproximativ zece ori mai eficient decât transformarea chimică (3).
     Procedeul este foarte eficient pentru introducerea de gene străine în culturile de celule, în special în liniile celulare de mamifere. De exemplu, procesul este utilizat la producerea șoarecilor knock-out (șoareci transgenici la care se inactivează o singură genă-țintă pentru studiul caracterelor fenotipice codificate de aceasta), precum și în tratamentul tumorilor, terapia genetică și terapia pe bază de celule. Procesul de introducere a unor molecule de ADN străine în celule eucariote este cunoscut sub numele de transfecție. Electroporarea este foarte eficientă pentru transfecția celulelor în suspensie în mediul de cultivare, folosind cuve de electroporare. Electroporarea a dovedit eficiență pentru utilizare pe țesuturi in vivo, pentru aplicații de transfecție in utero sau in ovo. Celulele aderente pe substrat pot fi, de asemenea, transfectate folosind electroporarea, oferind astfel cercetătorilor o alternativă pentru tripsinizarea celulelor înainte de transfecție.
     Electroporarea se realizează cu ajutorul electroporatoarelor, aparate care creează un câmp electromagnetic în suspensia celulară care se pipetează într-o cuvă de plastic sau sticlă prevăzută cu doi electrozi de aluminiu pe cele două laturi ale sale.
     Pentru electroporarea celulelor bacteriene se folosește o suspensie de cca 50 µl care se pune în contact, înainte de electroporare, cu plasmidul de interes. Amestecul se pipetează în cuvă, se setează tensiunea aplicată și volumul probei, iar cuva este introdusă în electroporator. Imediat după electroporare, 1 ml de mediu lichid se adaugă în cuvă/tub Eppendorf și se incubează la o temperatură care să permită multiplicarea bacteriilor, pentru a recupera celulele și a exprima rezistența la antibiotic, urmată de însămânțare pe plăci cu agar nutritiv. Pentru ca electroporarea să aibă succes, trebuie ca plasmidul să fie „free of all salts“, deoarece soluțiile cu concentrație mare de clorură de sodiu pot provoca o descărcare electrică (arc electric), fenomen care, de cele mai multe ori, reduce viabilitatea celulei.
     Pentru o investigație mai detaliată a procesului, ar trebui să se acorde atenție impedanței de ieșire a dispozitivului porator și impedanței de intrare a suspensiei de celule (ex.: conținutul de sare). Deoarece procesul necesită un contact electric direct între electrozi și suspensie și nu se produce între electrozi izolați, este evident că procesul presupune existența unor efecte electrolitice, datorate curenților de intensitate mică și câmpurilor electrice.
     Electroporatoarele sunt echipamente speciale de laborator care oferă posibilitatea realizării electroporării pentru probe multiple, în același timp cu ansambluri de electrozi speciali pentru culturi celulare, cum este sistemul Gemeni X2HT, fabricat de BTX Harvard. Electroporatoarele pot fi setate pentru diferiți parametri de funcționare, care să permită cercetătorilor să optimizeze puterea câmpului electric în funcție de tipul de celule și de prezența sau absența peretelui celular. Electroporatoarele au fost utilizate pe o gamă largă de celule, inclusiv Escherichia coli (pentru transformare) și celule de mamifere (neuroni, astrocite, neuroglii, limfocite, monocite, fibroblaști, celule epiteliale și endoteliale) de la oameni, șoareci, șobolani și maimuțe (pentru transfecție).

 

Mecanismele fizice ale electroporării

 

     Electroporarea permite introducerea în celulă a unor molecule de ADN, care nu au capacitatea de a traversa pasiv membrana celulară (bistratul lipidic hidrofob). Există mai multe moduri în care se pot produce modificări ale câmpului electric la nivelul membranei celulare, cu mecanisme și efecte total diferite. Avantajul electroporării rezidă din faptul că moleculele lipidice nu sunt alterate din punct de vedere chimic, iar membrana are capacitatea de a forma un por care va servi drept cale de conducere prin bistratul lipidic.
     Electroporarea este un proces cu mai multe etape și faze distincte (4). Inițial, trebuie aplicat un impuls electric scurt de 300–400 mV pentru mai puțin de 1 ms, care determină modificări la nivelul membranei legate de migrarea ionilor în soluția înconjurătoare. Odată atins domeniul critic, are loc o rearanjare locală rapidă a morfologiei lipidelor, iar structura rezultată este considerată a fi un „pre-por“, deoarece nu este bun conducător electric, dar conduce rapid la formarea unui por conductiv. Cele mai multe dovezi care vin în sprijinul acestei idei provin de la procesul de „flickering“ care se produce la nivelul preporilor, cu formarea de regiuni hidrofobe de aproximativ 3Å (5). Dacă această teorie este corectă, trecerea spre por conductor ar putea fi explicată printr-o rearanjare la marginea porilor, în care extremitățile lipidice creează o interfață hidrofilă. În cele din urmă, porii conductivi pot suferi procese de reorganizare, extindere sau rupere, care pot fi influențate de diferiți factori locali, cum ar fi punctul și momentul în care are loc modificarea, stresul mecanic și energia bistratului lipidic existentă la momentul producerii procesului (6).

 

Aplicații medicale

 

     Optimizarea condițiilor de electroporare este dificil de realizat, dar s-a demonstrat că electroporarea cu voltaj ridicat poate distruge aproape ireversibil celulele-țintă, celulele vecine rămânând neafectate. Astfel, electroporarea poate constitui o nouă cale terapeutică în tratamentul cancerului, al bolilor cardiace și al altor stări patologice care necesită excizii tisulare (7).
     O tehnică recentă, numită electroporare ireversibilă non-termică, s-a dovedit un succes în tratarea diferitelor tipuri de tumori. Această procedură presupune utilizarea de electrozi mici (aproximativ 1 mm în diametru), plasați în interiorul sau în jurul țesutului-țintă pentru a aplica impulsuri electrice scurte, repetitive, la o tensiune și o frecvență prestabilite, care cresc potențialul de repaus transmembranar. Ca urmare, atunci când energia electrică aplicată este mai mare decât valoarea-prag pentru țesutul-țintă, formarea de nanopori în membrana plasmatică poate deveni permanentă, iar mecanismele de reparare celulară a celulelor canceroase ,,nemuritoare“ devin ineficiente și celulele mor. Procedura este unică, deoarece, față de alte tehnici de ablație tumorală, nu afectează țesutul sănătos din jurul tumorii (8).
     În contrast, electroporarea reversibilă apare atunci când energia electrică aplicată prin intermediul electrozilor se află sub valoarea-prag a câmpului electric al țesutului-țintă. Aplicarea unei energii electrice sub valoarea-prag permite celulelor să își refacă stratul dublu fosfolipidic și să își reia funcționarea normală. Electroporarea reversibilă se realizează în mod normal pentru administrarea de tratamente care presupun introducerea unor molecule terapeutice (medicamente, gene etc.) în interiorul celulelor. Deoarece nu toate țesuturile au aceeași valoare-prag a câmpului electric, sunt necesare calcule precise înainte de începerea unui tratament, pentru a asigura eficiența administrării.
     Un avantaj major al folosirii electroporării ireversibile non-termice este că, atunci când se face corect, urmare a unor calcule atent efectuate, aceasta afectează doar țesutul-țintă, în timp ce proteinele, matricea extracelulară și unele structuri critice, cum ar fi vasele de sânge și nervii, rămân neafectate după tratament. Acest lucru permite o recuperare mai rapidă și facilitează o înlocuire mai rapidă a celulelor tumorale necrozate cu celule sănătoase.
     Primul tratament de succes al tumorilor cutanate maligne la șoareci a fost realizat în 2007, de Garcia și colab., cu ablația completă a tumorii la 12 din 13 șoareci. Ei au realizat acest lucru prin trimiterea a 80 de impulsuri de 100 µsec la 0,3 Hz, cu o amplitudine a câmpului electric de 2.500 V/cm, pentru a trata tumorile cutanate (8).
     Înainte de efectuarea procedurii, terapeutul trebuie să calculeze cu atenție pașii de urmat și să adapteze terapia pentru nevoile fiecărui pacient în parte cu ajutorul imagisticii (CT și RMN), pentru a obține o imagine tridimensională cât mai exactă a tumorii. Această informație este foarte importantă deoarece astfel se poate aproxima volumul tumorii și decide asupra tipului de terapie, locului și unghiului de inserție a electrozilor și tensiunii aplicate uneori chiar în timpul procedurii, mai ales atunci când electroporarea este utilizată pentru a trata tumorile cerebrale.
     Întreaga procedură este rapidă (cca 5 min), rata de succes este mare și deci foarte promițătoare pentru o viitoare extrapolare a tratamentului la om. Un dezavantaj ar fi acela că energia electrică eliberată poate stimula celulele musculare, determinând contracția acestora, lucru care în anumite situații poate avea consecințe grave sau chiar letale. Prin urmare, trebuie utilizat un agent miorelaxant (curarizant) în timpul efectuării procedurii. Cercetările realizate până în prezent au avut succes, dar trebuie acționat sub rezerva existenței unui risc atunci când se utilizează anestezia generală.
     O tehnică recentă, electroporarea ireversibilă de înaltă frecvență, folosește electrozi pentru a aplica impulsuri electrice bipolare la o frecvență mare, spre deosebire de impulsurile electrice unipolare la o frecvență joasă. Acest tip de procedură conduce tot la ablație tumorală, cu deosebirea că nu produce contracție musculară și de aceea nu este nevoie de un agent miorelaxant (8).
     Cercetătorii au avut succes în tratarea animalelor de laborator cu mai multe tipuri de tumori. Chiar dacă nu sunt pregătiți pentru a aplica și utiliza în mod curent această tehnică în tratarea tumorilor la om, electroporarea ireversibilă non-termică este utilizată în practică pentru a trata tumorile cutanate și subcutanate. Au existat și tentative pentru a trata la om cancerul de prostată, plămâni, rinichi și ficat. Mai există încă multe lucruri care trebuie puse la punct, legate de modul de afectare al animalelor și, în special, al omului. Kenneth Thompson și colab. au testat siguranța aplicării acestei tehnici la oameni cu tumori la nivelul plămânilor, rinichilor și ficatului. Tratamentul s-a dovedit eficient în 71% din cazuri, respectiv la 49 de pacienți din 69 s-a realizat ablația completă a tumorii (9). Rata cea mai mare de succes a fost înregistrată la tumorile hepatice. Rezultatele acestui studiu oferă astfel dovezi încurajatoare legate de utilizarea în viitor a acestei tehnologii ca o metodă alternativă de tratare a cancerului la om.
     Electroporarea poate fi utilizată și pentru introducerea de medicamente sau gene în celule țintă, prin aplicarea unor impulsuri electrice scurte și intense care să permeabilizeze tranzitoriu membrana celulară. Această procedură este denumită electrochimioterapie, când moleculele care trebuie transportate sunt reprezentate de un agent chimioterapic, sau electrotransfer de gene, când molecula transportată este reprezentată de material genetic (ADN).

 

Aplicații farmaceutice

 

     Unele companii farmaceutice au realizat studii pentru dezvoltarea procedurilor de electroporare cu aplicații medicale, cu scopul de a oferi o alternativă viabilă absorbției unor medicamente la nivel celular. Această abordare se bazează pe faptul că celulele umane nu permit intrarea liberă a unor elemente străine prin membrana celulară, fapt care are ca rezultat întârzierea eficienței administrării unui medicament. De aceea, electroporarea poate constitui o soluție reală care să permită unui medicament să acționeze direct, rapid și cu maximă eficiență asupra celulelor și țesuturilor care necesită tratament, rezultatul fiind obținerea unui efect terapeutic bun, fără efecte secundare majore. De exemplu, Inovio și OncoSec au testat eficiența acestei tehnologii și au reușit, în 2013, să realizeze pași importanți în această direcție. Rezultatele le-au permis și obținerea de câștiguri substanțiale: Inovio Pharmaceuticals a avut creșteri ale profitului de aproape 500%, iar OncoSec Medical de 150%. Inovio realizează studii folosind vaccinuri sintetice, în timp ce OncoSec testează agenți terapeutici deja utilizați în tratamentul cancerului.
     Au fost dezvoltate aproximativ douăsprezece tratamente prin electroporare de Inovio, pentru tratamentul cancerului și al bolilor infecțioase. Astfel, testele realizate pe vaccinul gripal H1N1 au evidențiat răspuns imun protector comparabil cu vaccinurile convenționale. De asemenea, vaccinul SynCon DNA a determinat protecție totală față de infecția cu virusurile febrelor hemoragice Ebola și Marburg. Studiile preliminare pentru ambele tipuri de vaccin, deși sunt în faza inițială, arată că acestea prezintă un puternic efect împotriva răspândirii acestor virusuri mortale. În 2014, compania a anunțat că vaccinul experimental H7N9 a generat anticorpi hemaglutinanți protectori la 100% din animalele testate. Tot în 2014, compania amintită a anunțat că electroporarea îmbunătățește semnificativ rezultatele terapiei ADN, în sensul stimulării multiplicării elementelor sanguine. La rândul său, OncoSec a realizat studii preclinice pentru tratarea melanomului metastatic, a carcinomului cu celule Merkel (MCC) și a limfomului cutanat cu celule T. În studiu au fost incluși 15 pacienți cu MCC, iar până în prezent platforma de electroporare a companiei s-a dovedit a fi sigură, la ultima verificare toți pacienții prezentând o creștere a absorbției IL-12 de cel puțin o sută de ori (în unele cazuri, de până la o mie de ori). Acest fapt oferă speranță în ceea ce privește reducerea efectelor secundare care apar ulterior imunoterapiei. De asemenea, au fost realizate studii pe melanom la un grup de 25 de pacienți. Au fost raportate fișele complete pentru 21 dintre aceștia și s-a observat că 38,1% au prezentat răspuns complet favorabil pe o durată mai mare de șase luni, iar la 61,1% din pacienți s-a observat și o regresie a tumorii de 30%.
     Se consideră că viitorul apropiat va aduce o serie de noutăți în acest domeniu, cum ar fi: extinderea studiilor și obținerea unor rezultate pozitive, pentru mai mult decât populații mici de pacienți; raportarea datelor studiului de fază 2 pentru VGX-3100 în tratamentul displaziei de col uterin (în faza 1 a demonstrat răspuns imun bun); raportarea datelor finale ale studiului pentru melanom și pentru carcinomul cu celule Merkel; prezentarea planurilor de lansare pentru un studiu de tratare a limfomului cutanat cu celule T, dar și a celor de inițiere a unei noi cercetări pentru tratarea de tumori solide; combinarea dispozitivul de electroporare cu anti-CTLA4, anti-PD-1 și anti-PD-L1 (în mod special anti-PD-L1s) a fost printre cele mai des discutate potențiale terapii ale cancerului după ce două companii farmaceutice au raportat date promițătoare la congresul Societății americane de oncologie clinică (ASCO). Toate acestea au condus la ideea că electroporarea poate crește asimilarea unor agenți terapeutici, scăzând totodată efectele secundare ale acestora și crescându-le eficiența.

 

Concluzii

 

     Electroporarea terapeutică este o tehnologie nouă pentru tratamentul la nivel celular, in vivo. Metoda se bazează pe electroporarea membranei celulare, care devine permeabilă selectiv pentru agenții terapeutici utilizati. Experimentele in vitro și in silico sunt promițătoare și au permis introducerea de molecule chimice și biologice în celulele-țintă. Experimentele in vivo pe animale de experiență au dat rezultate terapeutice bune, deci în viitor ar putea fi aplicate și la om.
     Electroporarea terapeutică poate să devină, în viitorul apropiat, un tratament important pentru bolile oncologice, cardiace, infecțioase etc., prefigurând perspectiva predominant biologică a terapeuticii în medicina modernă.
Bibliografie

1. Neumann E et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1982;1(7):841-5

2. Ivorra A, Rubinsky B. Gels with predetermined conductivity used in electroporation of tissue, USPTO Application: 20080214986 – Class: 604 21

3. Sugar IP, Neumann E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 1984 May;19(3):211-25

4. Weaver JC, Chizmadzhev YA. Theory of electroporation: a review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1996;41(2):135-60

5. Becker SM, Kuznetsov AV. Local temperature rises influence in vivo electroporation pore development: a numerical stratum corneum lipid phase transition model. J Biomech Eng. 2007 Oct;129(5):712-21

6. Melikov KC et al. Voltage-induced nonconductive pre-pores and metastable single pores in unmodified planar lipid bilayer. Biophys J. 2001 Apr;80(4):1829-36

7. Rubinsky B et al. Irreversible electroporation: a new ablation modality--clinical implications. Technol Cancer Res Treat. 2007 Feb;6(1):37-48

8. Garcia PA et al. Electrical conductivity changes during irreversible electroporation treatment of brain cancer. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, 2011

9. Thomson KR et al. Investigation of the safety of irreversible electroporation in humans. J Vasc Interv Radiol. 2011 May;22(5):611-21

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
  • Tipărit + digital – 200 de lei
  • Digital – 129 lei
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
  • Colegiul Medicilor Stomatologi din România – 5 ore de EMC
  • Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
  • OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
  • OAMGMAMR – 5 ore de EMC
Află mai multe informații despre oferta de abonare.