Prima etapă în evoluţia medicinii tradiţionale
spre medicina genomică s-a derulat în ultimele decenii ale secolului XX, fiind
marcată de o veritabilă revoluţie
tehnologică în biologie şi medicină, comparabilă – prin consecinţe – cu descoperirea
microscopului. Până în 1970, genele erau entităţi materiale inaccesibile
investigării directe, din cauza dimensiunilor foarte mici şi imposibilităţii obţinerii
unei cantităţi suficiente de material genetic pur pentru analiză. În acel an,
s-au descoperit enzimele de restricţie cu ajutorul cărora a devenit posibilă
secţionarea ADN şi izolarea genelor. Ulterior, au fost introduse alte noi
tehnologii de studiu ADN, care au făcut posibilă combinarea moleculelor de ADN
de la diferite specii (ADN recombinant), multiplicarea (amplificarea) genelor,
precum şi analiza structurii şi funcţiei genelor sau identificarea mutaţiilor.
Toate aceste descoperiri, încununate cu cinci premii Nobel, au inaugurat „era
ingineriei moleculare“, care a schimbat statutul geneticienilor, transformându-i
din „observatori“ în „manipulatori“ de gene. Genetica iese din cadrul său
abstract şi începe o nouă eră, cea a
geneticii şi medicinii moleculare. Pentru toţi cei care vor urmări, în
această rubrică, evoluţia cunoaşterii spre medicina genomică, considerăm utilă înţelegerea
instrumentelor de lucru şi dobândirea unui vocabular operaţional.
Pentru obţinerea unor gene sau fragmente de
ADN în vederea amplificării şi analizei ulterioare, cel mai frecvent se foloseşte
secţionarea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor
de restricţie. Ele sunt mijloace naturale de apărare ale unor bacterii
contra infecţiilor virale (bacteriofagi), prin care reuşesc să limiteze (în
engleză, „to restrict“) multiplicarea
virusului infectant, printr-un proces în care ADN fagic este recunoscut
selectiv şi degradat enzimatic, în timp ce ADN bacterian rămâne protejat de
această acţiune distructivă.
Enzimele de restricţie nu secţionează ADN la
întâmplare, ci au un grad înalt de specificitate: ele „scanează“ ADN şi se
opresc atunci când recunosc o secvenţă nucleotidică specifică, numită situs de
recunoaştere şi clivare sau, pe scurt, situs
de restricţie, la nivelul căruia secţionează ADN. În felul acesta, se obţine un număr definit şi reproductibil de
fragmente inegale, care pot fi uşor separate prin electroforeză. În afara
acestor particularităţi, trebuie să precizăm un alt lucru important: o anumită
enzimă de restricţie produce capete adezive identice atunci când secţionează
molecule de ADN diferite. Datorită acestei caracteristici, două fragmente de
ADN cu origini diferite (de exemplu, om şi bacterie) dar produse cu aceeaşi
enzimă de restricţie se pot uni pe bază de complementaritate, producând o moleculă hibridă de ADN, numită ADN recombinant. Enzimele de restricţie
au devenit instrumentul de bază al ingineriei genetice, „bisturiul“ cu care se
fac toate „operaţiile“ moleculare asupra ADN: incizii, amputaţii şi mai ales
„transplanturi“ de gene.
O altă metodă utilizată în vederea obţinerii
de gene foloseşte ca material de lucru ARN mesager (ARNm), produsul
(transcriptul) primar al genei, extras din citoplasma unei celule care îl
sintetizează din abundenţă (de exemplu, ARNm pentru beta-globină izolat din
hematiile tinere). Molecula monocatenară de ARNm serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene de ADN
complementar (ADNc), realizată de o enzimă numită transcriptază inversă.
Pe baza primei catene de ADN se sintetizează şi cea de a doua catenă,
complementară ei: se obţine astfel o moleculă ADNc bicatenar care va corespunde
genei (mai exact segmentelor transcrise, exonilor, din genă). În acest mod s-a
sintetizat pentru prima dată gena pentru beta-globină, implicată în producerea
beta-talasemiilor.
Ultima metodă destinată obţinerii unor
segmente de ADN este sinteza chimică,
artificială, bazată pe polimerizarea dezoxiribonucleotidelor ce alcătuiesc o
catenă de ADN, într-o ordine determinată anterior. Această tehnică se foloseşte
cu precădere pentru obţinerea unor oligonucleotide corespunzătoare unei părţi din genă, utilizate fie ca sonde, fie ca amorse, în alte tehnici de analiză moleculară.
După obţinerea unor gene/segmente de ADN,
etapa următoare o reprezintă multiplicarea/amplificarea lor într-o cantitate
suficientă pentru analiză; aceasta se realizează prin multiple runde de
replicare selectivă a ADN (realizate de ADN polimeraze), fie in vivo (clonare celulară), folosind
mecanismul natural al replicării ADN, fie in
vitro (clonare acelulară), bazată
pe reacţia de polimerizare în lanţ („polymerase
chain reaction“ – PCR).
Clonarea celulară a ADN presupune inserţia genei umane într-un
vector (plasmide, bacteriofagi, cromozomi artificiali) şi introducerea ADN
recombinant (format din ADN uman şi ADN al vectorului) într-o celulă gazdă (bacterii, levuri etc.), unde va fi
multiplicat, prin replicare. Deoarece vectorii recombinanţi pot produce un număr
mare de copii per celulă (folosind maşinăria de replicare a gazdei) şi întrucât
gazdele pot fi crescute indefinit în laborator, se pot obţine mari cantităţi
din fragmentul de ADN inserat (genă). Metoda clonării celulare, larg utilizată
la începuturile perioadei tehnologiei ADN recombinant, implicit pentru a secvenţia
genomul uman, este puţin folosită în prezent, fiind înlocuită de alte metode.
Clonarea acelulară se bazează pe reacţia de polimerizare în
lanţ (PCR) ce permite amplificarea selectivă a unei secvenţe scurte de ADN sau
ARN, a cărei structură nucleotidică este parţial cunoscută. Prin această metodă,
plecând de la o cantitate infimă de ADN (chiar şi de la o singură celulă) se
poate obţine o cantitate suficientă de ADN-ţintă. Amplificarea este
considerabilă (de miliarde de ori) şi rapidă (în câteva ore), permiţând obţinerea
automatizată a unei cantităţi suficiente de material genetic pentru analiză.
Metoda PCR – simplă, rapidă, sensibilă – a
devenit principala metodă de analiză genotipică, fiind dezvoltată astăzi într-o
multitudine de variante.
După izolarea şi amplificarea unui fragment
de ADN (genă), etapa principală de analiză genotipică este determinarea secvenţei nucleotidice, deci a informaţiei genetice
conţinute de fragmentul respectiv. Metodele folosite pentru secvenţierea ADN au fost descoperite
independent de Walter Gilbert (tehnica de degradare chimică) şi Fred Sanger
(tehnica de sinteză enzimatică), care, în 1980, au primit împreună premiul
Nobel pentru chimie. Secvenţierea ADN este decisivă pentru a stabili structura
genei şi implicit secvenţa de aminoacizi a proteinei codificate de genă (în
cazul în care ea nu a fost identificată). De asemenea, se poate determina tipul
de mutaţie care a produs o boală genetică. Secvenţierea ADN a devenit astfel
indispensabilă pentru cercetările ştiinţifice – culminând cu secvenţierea
genomului uman şi a altor organisme – dar şi pentru diagnostic sau
biotehnologie.
Pentru detecţia şi analiza acizilor
nucleici, inclusiv pentru a pune diagnosticul
molecular al unei boli la o anumită persoană, se folosesc iniţial metode
mai simple. Ele utilizează o sondă
genotipică adecvată, care permite identificarea într-o probă test, fie a
unei gene (metode directe), fie a unor markeri genotipici (secvenţe necodante)
situaţi în vecinătatea genei (metode indirecte). Această recunoaştere se bazează
pe principiul hibridizării moleculare a
acizilor nucleici pe baza complementarităţii
secvenţelor lor. Sonda monocatenară
de acid nucleic (un oligonucleotid cu o secvenţă cunoscută) se va fixa specific
şi stabil pe secvenţa sa complementară din proba test (de obicei imobilizată pe
un suport solid) formând un hibrid molecular (sondă-ţintă). Pentru a identifica
acest heteroduplex, sonda este marcată cu un trasor radioactiv sau cu un compus
fluorescent; prin detecţia semnalului se va identifica prezenţa genei ce posedă
o secvenţă de ADN omoloagă sondei folosite; absenţa semnalului relevă deleţia
genei. Fenomenul este de o specificitate
extraordinară, pentru că o sondă este capabilă să recunoască o secvenţă
unică printre milioane de alte secvenţe, obţinute prin fragmentarea ADN genomic
cu o anumită enzimă de restricţie.
Hibridizarea moleculară a acizilor nucleici
pe baza complementarităţii lor stă la baza diferitelor metode de analiză
moleculară, la nivel genic, care au permis creşterea considerabilă a capacităţii
de identificare a unor mutaţii implicate în producerea a numeroase boli,
indiferent de vârsta pacientului (făt, nou-născut, copil, adult) şi deseori înainte
de manifestarea clinică (diagnostic presimptomatic). De asemenea, cu ajutorul
unor sonde specifice se pot detecta genomurile unor bacterii, virusuri, paraziţi
ce infectează organismul uman. Diagnosticul genotipic a devenit astfel o nouă şi
eficace acţiune în medicina practică.
Iniţial,
noile metodologii ale geneticii moleculare au fost receptate de către lumea ştiinţifică
cu justificată teamă, atribuindu-li-se pericolul unor consecinţe nefaste şi
necontrolabile. Rezervele s-au dovedit ulterior mai puţin justificate şi,
treptat, „ingineria genetică“, simplificându-şi procedurile iniţiale, luând măsuri
speciale de limitare a pericolelor potenţiale şi crescându-şi gradul de
accesibilitate, a „invadat“ toate sectoarele biologiei şi în special medicina,
care a devenit moleculară. Dar, despre acest aspect vom discuta în articolul
următor. 
