Autentificare
Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta
Căutare:
Căutare:
Acasă

Culturile celulare

Viața Medicală
Dr. Nicoleta-Monica FOTEA vineri, 13 ianuarie 2017
     Cultura celulară este procesul prin care celulele sunt crescute în condiții controlate, cel mai frecvent în afara mediului natural. Condițiile de cultivare diferă în funcție de tipul celular, dar, în general, acestea sunt un substrat-placă cu mediu care furnizează nutrienții necesari creșterii și un incubator care reglează caracteristicile fizico-chimice (pH, presiune, concentrație de CO2, presiune osmotică și temperatură). Deși cele mai multe tipuri celulare necesită un substrat de care să adere, denumite culturi monostrat sau culturi aderente, alte tipuri cresc flotând liber în mediu (culturi în suspensie).
     Celulele pot fi îndepărtate din țesutul inițial direct sau prin metode enzimatice sau mecanice înainte de cultivare sau pot fi derivate din linii celulare deja stabilite.
     Cultura primară reprezintă etapa ulterioară izolării și proliferării în condiții optime până când aceasta ocupă întreg substratul (cultură celulară la confluență). În această fază, celulele trebuie subcultivate (pasate) prin transferarea lor pe un nou substrat cu mediu proaspăt, pentru a asigura spațiul necesar multiplicării. Primele subculturi care derivă din cultura primară au o durată de viață scurtă (trei-cinci cicluri), dar, pe parcursul pasajelor, sunt selectate celulele cu cea mai mare capacitate de diviziune, dând naștere astfel unei populații uniforme din punct de vedere genotipic și fenotipic, denumită linie celulară. Deși liniile celulare sunt mai frecvent utilizate datorită facilității și reproductivității, reprezintă opțiuni mai puțin relevante din punct de vedere biologic pentru că se îndepărtează funcțional și morfologic de cele din țesutul original. O tulpină celulară este o subpopulație a unei linii celulare care a fost selectată prin diferite metode, aceasta având adeseori modificări genetice adiționale față de linia parentală.
     Celulele normale se divid de un număr limitat de ori înainte de a-și pierde capacitatea de proliferare, proces determinat genetic și cunoscut sub numele de senescență. Aceste tipuri de celule alcătuiesc culturi finite. Prin procesul de transformare, spontan sau indus, unele linii celulare devin imortale, ceea ce presupune capacitatea de a multiplica la infinit, denumite linii celulare continue.
     Celulele în cultură pot fi clasificate în funcție de multiple caracteristici. Din punct de vedere morfologic există trei mari tipuri celulare: fibroblaste – celule bipolare sau multipolare, cu formă alungită, care cresc prin atașare la substrat; celule epiteliale – celule poligonale cu dimensiuni regulate, care cresc în grupuri prin atașare la sub­strat; limfoblaste – celule sferice, care cresc în suspensie fără a se atașa de un substrat.

 

Linii celulare utilizate frecvent

 

     Celulele HeLa (fig. 1) sunt celule canceroase cervicale umane, cultivate pentru prima dată în laborator în 1951 și reprezintă prima linie celulară continuă (1). În prezent, există mai multe tulpini de celule HeLa. Primele celule au provenit dintr-o probă recoltată de la o femeie pe nume Henrietta Lacks și au fost numite preluând primele două litere ale numele și prenumelui. Medicul George Gey este cel care a generat această linie celulară și cel care avea să o distribuie și celorlalți cercetători din întreaga lume pentru a o folosi la diverse experimente. Pe celulele HeLa s-a dezvoltat vaccinul poliomielitic, s-au testat diferite tipuri de toxine și radiații, s-au investigat infecția HIV/SIDA, procesul de oncogeneză sau medicamente antitumorale. Pe lângă rolul important în evoluția culturilor celulare, aceste celule au ridicat și numeroase controverse etice privind confidențialitatea datelor pacienților de la care se recoltează organe și țesuturi.
     Linia celulară HEK293 (fig. 2) este o linie celulară continuă derivată din celule embrionare renale umane transformate prin intermediul adenovirusului tip 5 (2). Genele virale ce se exprimă în această linie celulară determină producerea unui număr mare de proteine recombinante. Aceasta este folosită frecvent pentru transfecții, în special atunci când se folosesc ca vectori adeno- sau retrovirusuri. Este necunoscut ce tip de celule sunt HEK293 și este dificil a se concluziona după transformare, pentru că includerea unei segment viral de 4,5 kilobaze a modificat semnificativ morfologia celulară și expresia genetică, la aceste impedimente adăugându-se diversitatea celulară a rinichiului embriologic, care cuprinde aproape toate tipurile celulare. Se presupune că acestea ar fi de origine neuronală pe baza mARN și a proteinelor specifice neuronilor, dar sunt și dovezi ale provenienței din glandele adrenale sau fibroblaste (3).
     Celulele stem mezenchimale (MSC) derivă din mezoderm și dau naștere diferitelor tipuri de țesuturi, printre care os, cartilaj și țesut adipos (4). Spre deosebire de mezenchim, care produce atât țesut conjunctiv, cât și țesut hematopoietic, MSC nu dau naștere la celule hematopoietice. O caracteristică importantă a acestor celule este aceea că, într-un mediu optim de cultură, se pot divide, păstrându-și proprietățile de celulă stem pluripotentă, iar atunci când sunt cultivate în medii diferite de diferențiere dau naștere la miocite, adipocite, condrocite sau osteocite.

 

Selectarea liniei adecvate

 

     Selectare liniei celulare adecvate pentru un experiment trebuie să aibă în vedere mai multe criterii.
     Specia: liniile celulare non-umane impun mai puține restricții de biosiguranță, dar nu pot fi întotdeauna folosite în anumite experimente ce studiază expresia unor molecule specifice numai speciei umane.
     Contaminarea: una dintre cele mai frecvente probleme întâlnite în laboratoarele de culturi celulare este contaminarea culturilor. O infecție poate altera semnificativ biologia celulelor și compromite rezultatul experimentelor. Dacă o infecție bacteriană sau fungică este mai ușor de detectat, cele date de virusuri sau de Mycoplasmaspp. sunt mai dificil de identificat.
     Autenticitatea liniei celulare: este important ca, la începutul experimentelor cu o nouă linie celulară, să se verifice dacă linia este sau nu contaminată cu alte linii. Pentru a identifica precis tipul celular, se poate folosi tehnica STR (short tandem repeats) sau cariotiparea. Riscul de a întâlni o linie celulară „impură” este mare, având în vedere că există peste patru sute de linii celulare incorect identificate înregistrate în baza de date ICLAC (International Cell Line Authentication Committee) (5).
     Pasajul: liniile celulare canceroase, din pricina instabilității genetice, prin pasaje succesive, își vor modifica expresia la nivel molecular, ceea ce duce la o îndepărtare de celulele inițiale (6). Pentru a evita acest inconvenient, se recomandă a se păstra stocuri provenind dintr-un pasaj mic și decongelarea ulterioară, cu reluarea culturii. Uneori, modificarea culturilor este vizibilă, cum este cazul celulelor U87, care, după cultivări succesive, își pierd proprietatea de a crește în monostrat și se identifică drept sferoizi pe flask.
     Celule normale sau transformate: liniile celulare transformate au o rată de multiplicare mai mare și se divid infinit, solicită mai puțin ser în mediu, dar fenotipul lor a fost modificat prin mutații genetice care pot influența rezultatul experimentului.
     Parametrii de creștere: care sunt condițiile pentru optimizarea creșterii, densității sau clonării? De exemplu, pentru a se obține la rate înalte o proteină recombinată, se preferă o linie celulară cu un timp de dedublare scurt și o rată de creștere mare.
     Cultură finită sau continuă: dacă în culturi finite liniile celulare exprimă funcțiile corecte, apropiate de cele ale țesutului inițial, culturile continue sunt mai ușor de menținut in vitro sau de clonat.
     Alte aspecte: dacă se folosește o cultură finită, sunt stocurile suficiente pentru a realiza toate experimentele? Este linia celulară bine caracterizată în literatură sau necesită o validare proprie? În cazul în care se folosesc culturi transformate, trebuie să se realizeze aceleași experimente și pentru linia normală care este folosită în acest caz ca și control. Dacă linia celulară nu este stabilă, ea trebuie crioprezervată.
Bibliografie

1. Landry JJ et al. The genomic and transcriptomic landscape of a HeLa cell line. G3 (Bethesda). 2013 Aug 7;3(8):1213-24

2. Louis N et al. Cloning and sequencing of the cellular-viral junctions from the human adenovirus type 5 transformed 293 cell line. Virology. 1997 Jul 7;233(2):423-9

3. Stepanenko AA, Dmitrenko VV. HEK293 in cell biology and cancer research: phenotype, karyotype, tumorigenicity, and stress-induced genome-phenotype evolution. Gene. 2015 Sep 15;569(2):182-90

4. Dang SM, Zandstra PW. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol Biol. 2005;290:353-64

5. Capes-Davis A et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. Int J Cancer. 2010 Jul 1;127(1):1-8

6. Domcke S et al. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 2013;4:2126

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
  • Tipărit + digital – 200 de lei
  • Digital – 129 lei
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
  • Colegiul Medicilor Stomatologi din România – 5 ore de EMC
  • Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
  • OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
  • OAMGMAMR – 5 ore de EMC
Află mai multe informații despre oferta de abonare.