Genomul
uman, alcătuit din 3 x 109 perechi de baze, este împachetat în 23 de
perechi de cromozomi (22 de perechi de cromozomi autozomali și una de cromozomi
sexuali). Alterarea calitativă sau cantitativă a structurii cromozomiale are o
incidență de aproximativ 1% în populația generală și este responsabilă de peste
50% din avorturile spontane. Asocierea între anomaliile cromozomiale și patologie
a fost demonstrată pentru prima dată în 19591, când s-a arătat că
sindromul Down este expresia trisomiei 21. La scurtă vreme, în leucemia cronică
granulocitară, avea să fie evidențiat cromozomul Philadelphia, rezultat din
translația unei porțiuni din cromozomul 9, ce codifică gena ABL1, la nivelul
cromozomului 22, unde se află gena BCR2.
Analiza
citogenetică standard se referă la examinarea cromozomilor
ulterior bandării lor. O bandă cromozomială este definită ca fiind o porțiune a
unui cromozom ce poate fi clar diferențiată de segmentele adiacente, datorită
unei colorări mai reduse sau mai intense. Analiza citogenetică se realizează în
general pe celule aflate în mitoză, care se divid în mod activ. Celulele cele
mai utilizate pentru această analiză sunt cele din sângele periferic. Alte
tipuri celulare utilizate în cariotipare sunt: fibroblaști, țesut tumoral,
lichid amniotic sau țesut placentar. Etapele propriu-zise ale acestei analize
includ tratarea celulelor cu un inhibitor al fusului de diviziune, care
împiedică separarea cromatidelor în timpului metafazei, etapă obligatorie
întrucât în acest moment cromozomii sunt la un nivel optim de condensare.
Urmează apoi adăugarea unei enzime proteolitice, care realizează digestia
proteinelor ce mențin structura complexă a ADN, pentru a permite mai apoi
pătrunderea colorantului. Etapa de colorare diferă în funcție de substanțele
folosite; amintim aici bandările G (cea mai utilizată), C, R sau cu quinacrină.
În bandarea G (fig. 1), rezultă o succesiune de benzi deschise și
închise care se succed după un model specific fiecărui cromozom.
Cariotipul
uman normal este standardizat, ceea ce permite descrierea variantelor sau a
rearanjărilor patologice. În structura unui cromozom se descriu zona
centromerică (esențială pentru segregarea corectă a cromozomilor în meioză și
mitoză), două brațe (brațul scurt p și brațul lung q), precum și
două extremități terminale (telomerii). Fiecare cromozom este împărțit în
segmente care sunt numărate și mai apoi subdivizate. Fiecare dintre aceste
benzi sunt notate într-un document internațional și permit precizarea anomaliei
cu identificarea benzii duplicate, deletate sau cu rearanjări. Dezavantajele
acestei tehnici sunt limita inferioară de detecție (între cinci și opt milioane
de perechi de baze) și utilizarea exclusivă a celulelor aflate în diviziune.
Avantajele sunt detectarea delețiilor și a duplicațiilor, precum și a translocațiilor
echilibrate (schimbul de segmente cromozomiale între cel puțin doi cromozomi,
dar care nu duce la pierderea de segmente cromozomiale). Acestea din urmă au un
rol important pentru că predispun la segregări anormale în timpul meiozei, care
se asociază cu un risc mai mare de infertilitate, nașterea unor copii cu
multiple malformații congenitale. Aceste fenotipuri apar atunci când numai unul
dintre cromozomii ce participă la translocație este moștenit de la părintele cu
translocație echilibrată.
Rezoluția
mică a metodei citogenetice de cariotipare și nerecunoașterea unor modele de
bandare noi au dus la dezvoltarea tehnicilor citogenetice moleculare. La aceste
dezavantaje se adaugă utilizarea exclusivă a celulelor aflate în diviziune,
care nu se pot obține întotdeauna (de exemplu, neuronii sunt celule
postmitotice), iar celulele aflate în mitoză pot să nu fie reprezentative
pentru întreaga populație celulară investigată.
FISH
sau hibridizarea fluorescentă in situpoate fi realizată pe
celule în diviziune (FISH metafază) sau pe celule neangajate în mitoză (FISH
interfază) (fig. 2). Fluorescența in situ se bazează pe
complementaritatea dintre cele două lanțuri de ADN dublu spiralat și folosește
o probă moleculară, care poate fi o secvență ADN specifică, o secvență
repetitivă sau un mix de secvențe ce se găsesc la nivelul întregului cromozom.
Cel mai frecvent sunt utilizate secvențele specifice unui locus, pentru a
demonstra prezența unei secvențe caracteristice unei boli sau absența acesteia.
FISH identifică modificările structurale pentru că se folosesc probe care
recunosc ambele părți ale unei zonei de translocație. În cazul în care
translocația nu este prezentă, cele două probe se suprapun, pe când, dacă este
prezentă, cele două probe vor apărea separate una de cealaltă. Limita
inferioară pentru detecția unei anomalii este de 40–200.000 de perechi de baze.
Avantajele FISH interfază sunt că, spre deosebire de citogenetica standard, are
o rezoluție mai bună și permite și utilizarea de celule non-mitotice,
dezavantajele fiind acelea că mutația căutată trebuie cunoscută în prealabil
pentru a construi proba moleculară, iar numărul de mutații/celulă este limitat
de numărul de probe fluorescente.
O
altă metodă cu rezoluție înaltă pentru celulele ce nu se află în diviziune este hibridizarea genomică comparativă pe microcipuri (aCGH) (fig. 3).
Pentru aceasta, ADN-ul genomic al secvenței de analizat este fragmentat și
marcat cu un colorant verde fluorescent, pe când ADN-ul de control este marcat
în roșu. Apoi, atât controlul, cât și proba sunt hibridizate pe microcipuri ce
conțin mii de probe ce țintesc multiple gene și segmente cromozomiale.
Semnalele fluorescente sunt detectate de scanner. În exemplul dat, un semnal
verde reprezintă o amplificare a unei regiuni specifice sau al unui întreg
cromozom, iar semnalul roșu o deleție. Rezoluția este de aproximativ 400.000 de
perechi de baze, suficient pentru a detecta variații ale numărului de copii ADN
(CNV) pentru diferite locusuri. O limitare a aCGH este imposibilitatea de a
detecta translocațiile reciproce, inversiile, inserțiile, pentru că astfel de
anomalii nu duc la schimbarea numărului de cromozomi.CNV sunt alterări ale ADN celular ce rezultă
în urma unui variații normale sau patologice a numărului de copii a uneia sau
mai multor secvențe ADN. Astfel, se pot detecta CNV fără o semnificație clară,
ce necesită studii ulterioare, sau CNV cu semnificație necunoscută,
neinterpretabile. De asemenea, pentru că în mod obișnuit este hibridizat ADN
din fragmentele tumorale, CNV caracterizează în proporții variabile celulele ce
alcătuiesc fragmentele tumorale.
O
altă tehnică bazată pe microcipuri este detecția polimorfismelor la nivelul
unei baze nucleotidice (SNP). În locul hibridizării competitive a probei și
al controlului din aCGH, în SNP numai proba este hibridizată pe un microcip cu
aproximativ 100.000 de probe de tip SNP. CNV este determinat apoi prin
compararea semnalului fluorescent al probei cu cel al unui control hibridizat
separat. Pe lângă detecția CNV, tehnica SNP este utilizată și pentru
investigarea genomului cu exces de gene homozigote și absența celor heterozigote.
Absența heterozigoției este uneori asociată cu disomia monoparentală, dar se
întâlnește și în cazul în care părinții unui individ sunt consanguini.
Deși
tehnologia cu microcipuri (denumită generic citogenomică) a îmbunătățit
limitele de detecție, aceasta nu poate detecta modificările structurale, pentru
că ADN este fragmentat pentru o mai bună hibridizare pe microcip. De aceea,
pentru descrierea completă a unei anomalii cromozomiale, se folosesc tehnici
atât de citogenomică, cât și de citogenetică. O sinteză a avantajelor și a
dezavantajelor tehnicilor de cariotipare se regăsește în tabelul
alăturat.
Notă autor:
Bibliografie
1. Lejeune J et al. Le mongolisme, maladie chromosomique. (trisomie). Bull Acad Natl Med. 1959 Apr 7-14;143(11-12):256-65
2. National Academy of Sciences. Abstracts of papers presented at the Autumn Meeting, 14-16 November 1960, Philadelphia, Pennsylvania. Nowell PC, Hungerford DA. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia. Science. 1960 Nov 18;132(3438):1497
3. Gray JW et al. Flow karyotyping and sorting of human chromosomes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:141-9
4. Wang T et al. Detection of complex deletions in chromosomes 13 and 21 in a fetus by noninvasive prenatal testing. Mol Cytogenet. 2016 Jan 12;9:3
Abonează-te la Viața Medicală!
Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, publicația profesională, socială și culturală a profesioniștilor în Sănătate din România!
Cookie-urile ne ajută să vă îmbunătățim experiența pe site-ul nostru. Prin continuarea navigării pe site-ul www.viata-medicala.ro, veți accepta implicit folosirea de cookie-uri pe parcursul vizitei dumneavoastră.