Autentificare
Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta
Căutare:
Căutare:
Acasă

Rolul noilor tehnici de secvențiere

Viața Medicală
Dr. Nicoleta-Monica FOTEA vineri, 22 aprilie 2016
     Odată cu reducerea costurilor și apariția noilor metode, există posibilitatea de secvențiere a întregului exom sau genom, lăsând pe loc secund testarea țintită a unor gene considerate de clinician a se corela cu patologia și fenotipul bolii pacientului. Dacă, înainte de a dispune de noile tehnici de secvențiere (NGS), dimensiunea fragmentelor de ADN ce puteau fi secvențiate era limitată, în prezent, principala provocare este stabilirea contribuției pe care o are gena investigată asupra unui fenotip dat. Cu toate acestea, în clinică, principala utilitate a NGS este testarea genetică țintită și nu a întregului genom (WGS). Testele de secvențiere multigenice sau țintite au trei mari indicații: identificarea agenților patogeni în unele boli infecțioase; diagnosticarea maladiilor cu transmitere genetică; stabilirea conduitei terapeutice în anumite cancere somatice, indicație mai recent introdusă.
     Genele implicate în producerea unui fenotip poartă denumirea de locusul trăsăturilor cantitative (quantitative trait locus – QLT) (1). Determinarea QLT se face prin identificarea markerilor moleculari – cum sunt SNP (single nucleotide polymorphism) și AFLP (amplified fragment length polymorphism) – care se corelează cu o trăsătură observată. La polul opus se află cardiomiopatiile care au diferite prezentări clinice – dilatativă (CMD), hipertrofică (CMH) sau displazia aritmogenă de ventricul drept (2). Deși clinicianul poate să diferențieze între aceste entități, sunt și cazuri dificil de încadrat, care necesită testare genetică; 5–10% din cazurile diagnosticate cu CMH s-au dovedit a fi boli care mimează CMH (fenocopii), cea mai frecventă fiind boala Fabry, determinată de deficitul de alfa-galactozidază, iar 2% din pacienții cu CMH au variante patogene ale acestei gene (3). Importanța descoperirii mutației Gla este esențială, întrucât este singura din panelul genetic care permite un management țintit, prin terapia de substituție enzimatică. Acest argument a dus la includerea testării genei GLA în testele genetice destinate CMH.
     Multă vreme, testarea genetică a fost un mijloc marginal, de ultimă intenție diagnostică, după ce toate celelalte mijloace au fost epuizate. Odată cu acumularea de rezultate favorabile, locul geneticii în elucidarea etiologiei unor boli a crescut ca importanță.
     O nouă provocare pentru clinician este și alegerea între testele țintite și analiza întregului genom sau exom. Deși se folosește sintagma „secvențierea întregului genom“, aceasta mai degrabă ar trebui denumită parțială, pentru că nu este posibilă acoperirea în întregime, nici măcar a acelor regiuni genetice incluse în teste țintite.
     Atunci când se utilizează WGS, doi parametri sunt esențiali: numărul de citiri corespunzătoare pentru o anumită poziție (regăsit în literatura anglosaxonă ca sequencing depth) și indicele de acoperire (sequencing coverage). Numărul de citiri pentru o poziție reprezintă practic de câte ori a fost citită aceeași secvență: de exemplu, se estimează că, pentru a detecta cu o bună sensibilitate mutațiile la nivel de nucleotid, pentru genomul uman (care conține trei miliarde de nucleotide) este necesară generarea a 90 de miliarde de baze, prin urmare o multiplicare de treizeci de ori a fiecărei poziții. Practic, pentru un nucleotid specific, numărul de citiri reprezintă numărul de secvențe care au contribuit la acumularea de informații despre acel nucleotid. Este important de menționat că numărul de citiri variază de-a lungul diferitelor regiuni genomice, astfel încât anumite zone pot rămâne nesecvențiate, iar altele să fie secvențiate de multe ori. Indicele de acoperire este important pentru evidențierea rearanjamentelor, detectate prin analiza perechilor citite. În NGS, fragmentele ADN sunt de 50–100 de baze pentru fiecare capăt al secvenței de interes. Distanța estimată între perechile citite este utilizată pentru a plasa secvențele la nivelul genomului, iar cele neașteptate sunt utilizate pentru detecția anomaliilor structurale.
     În secvențierea exomului, acoperirea este între 90 și 95%, dar atunci când se folosesc regiuni genetice, indicele de acoperire este și mai mic. De exemplu, mai mult de 73 de gene sunt cunoscute a determina hipoacuzia non-sindromică (4); datele arată că indicele de acoperire este de 92%, cu precizarea că patru gene au o rată de secvențiere redusă, între 0 și 44% (5). În schimb, testarea țintită își completează indicele de acoperire prin secvențiere Sanger și alte tehnici, de exemplu, long-range PCR, o tehnică de amplificare a secvențelor ADN de dimensiuni mari care în mod obișnuit nu pot fi amplificate utilizând metode clasice. La aceasta se adaugă variația numărului de copii (copy number variation) pentru a evidenția delețiile mari sau alte mutații hetero- sau homozigote, care frecvent rămân nedetectate de secvențierea exomului. Acest exemplu ilustrează și recomandarea Colegiului american pentru genetică medicală și genomică, care indică secvențierea întregului exom numai în cazul în care bateriile de teste țintite sunt negative.
     Un alt inconvenient al WGS este returnarea a sute de mii și milioane de variante genetice, pentru că aceste analize se bazează pe variantele găsite în populația de control, care sunt filtrate, câteodată cu prezumpția benignității lor. În teste genetice țintite, interpretarea este realizată pentru fiecare variantă și raportarea se face inclusiv pentru variantele cu semnificație necunoscută. Astfel, la fiecare testare țintită se găsesc și variante genetice noi, care îmbogățesc cunoștințele despre genomul uman și eventuala lor implicare în patologie.
     Un alt potențial beneficiu al NGS l-ar putea reprezenta elucidarea mecanismelor patogenice ale oncogenezei în vederea îmbunătățirii diagnosticului și tratamentului cancerului. Grație NGS, este posibilă secvențierea genelor cu expresie la nivel celular – transcriptomul sau exomul.
     Un exemplu elocvent în această direcție este tratamentul în cancerul pulmonar asociat cu mutații ale EGFR (receptorul factorului de creștere epidermal) (6), prezente în special la pacienții cu adenocarcinoame pulmonare, mai frecvent la femei și nefumători. Medicamente țintite pe această mutație îmbunătățesc prognosticul pacienților, fără efect însă pe alte tipuri de tumori pulmonare sau chiar în cazul aceluiași timp de neoplazie dar fără mutația EFGR. Deși inițial s-a crezut că translocațiile sunt specifice hemopatiilor, care se pot detecta foarte ușor cu metode ieftine, citogenetice, NGS a modificat aceste cunoștințe prin evidențierea de translocații în tumori solide: cancerul de prostată și translocația între serin-proteaza 2 transmembranară și EFGR sau, în cancerul pulmonar cu celule mici, translocația între proteina echinodermică asociată microtubulilor tip 4 și ALK-tirozin-kinaza receptorului limfomului anaplazic.
     Secvențierea NGS a regiunilor țintite are numeroase avantaje comparativ cu secvențierea întregului genom: creșterea indicelui de acoperire a regiunilor de interes, scăderea costurilor și creșterea eficienței. Majoritatea metodelor ce folosesc secvențierea țintită cuprind o etapă de selecție a regiunilor de interes prin hibridizarea unor oligonucleotide specifice la genele vizate. Astfel, NGS a permis analiza tuturor genelor codante din cancerul colorectal, pancreatic, mamar și din glioblastom.
     Pe de altă parte, obținerea hărților cu secvențele nucleotidice ale țesuturilor tumorale nu este suficientă, ci trebuie integrată cu expresia la nivel celular. Legătura dintre secvența genetică și harta citogenetică necesită alte experimente. Într-un proiect interesant (Cancer Genome Anatomy Project), moleculele de ARNm au fost izolate din țesuturile tumorale și din cele normale pentru ca apoi să fie convertite în ADNc sau biblioteci de analiză seriată a expresiei genetice (SAGE) (7). Informațiile au fost depozitate în baze de date publice. Folosind aceste date, CGAP a realizat cartarea prin FISH a clonelor cromozomilor bacterieni artificiali utilizate pentru a genera secvențe genetice umane. Un cromozom bacterian artificial (BAC) este o moleculă de ADN care se poate transmite la bacterii și este util pentru a clona segmente de ADN de la alte specii, de interes, în acest caz cele umane. Pe baza acestor cromozomi artificiali bacterieni s-a realizat marcarea fluorescentă a benzilor citogenetice. Astfel, este posibilă identificarea clonei bacteriene care se colorează fluorescent la nivelul unei benzi citogenetice, citirea secvenței ADN de la nivelul cromozomului bacterian și asocierea acesteia cu secvența citogenetică. În această situație, BAC devine o punte de legătură care arată cum o mutație genomică acționează la nivel citogenetic.
     Cel mai bun exemplu este descoperirea imatinibului mesilat. Condiția obligatorie pentru a dezvolta noi tratamente care țintesc specific celulele tumorale este înțelegerea țintei pe care aceste medicamente trebuie să o atingă. Aproximativ 95% din cazurile de leucemie cronică mieloidă prezintă translocația ce implică regiunile BCR și ABL, de pe cromozomul 22, respectiv 9. Aceste mutații duc la producerea unei tirozinkinaze activate constituțional, specifică celulei tumorale. Imatinibul este un inhibitor selectiv al BCR-ABL-kinazei, care induce remisiunea la peste 90% din pacienți. Pe lângă BCR-ABL, medicamentul este activ și împotriva altor tirozinkinaze, pe c-kit și pe receptorul factorului de creștere derivat din plachete, având potențial și în alte malignități, cum sunt tumorile stromale gastrointestinale. Istoria arată succesul pe care îl au medicamentele ce țintesc mecanisme moleculare specifice celulelor transformate malign.
     Aplicațiile detaliate reprezintă numai o mică parte din potențialul pe care îl are NGS în cercetarea fundamentală, dar și în practica clinică.
Bibliografie

1. Miles C, Wayne M. Quantitative trait locus (QTL) analysis. Nature Education. 2008:1(1)

2. Teekakirikul P et al. Inherited cardiomyopathies: molecular genetics and clinical genetic testing in the postgenomic era. J Mol Diagn. 2013 Mar;15(2):158-70

3. Terryn W et al. Prevalence of Fabry disease in a predominantly hypertensive population with left ventricular hypertrophy. Int J Cardiol. 2013 Sep 10;167(6):2555-60

4. Hereditary Hearing Loss. hereditaryhearingloss.org

5. Rehm HL. Disease-targeted sequencing: a cornerstone in the clinic. Nat Rev Genet. 2013 Apr;14(4):295-300

6. Mitsudomi T et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 2010 Feb;11(2):121-8

7. Cheung VG et al. Integration of cytogenetic landmarks into the draft sequence of the human genome. Nature. 2001 Feb 15;409(6822):953-8

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
  • Tipărit + digital – 199 de lei
  • Digital – 149 lei
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
  • Colegiul Medicilor Stomatologi din România – 5 ore de EMC
  • Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
  • OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
  • OAMGMAMR – 5 ore de EMC