Autentificare
Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta
Căutare:
Căutare:
Acasă

Universul CRISPR/Cas9

Viața Medicală
Dr. Nicoleta-Monica FOTEA vineri, 15 iulie 2016
     CRISPR/Cas, o nouă modalitate de editare a genomului ce poate modifica ADN-ul cu înaltă acuratețe, a fost prezentată în 2012 de cercetători de la Universitatea Berkeley din California. Dar, de fapt, istoria CRISPR este mult mai veche și reprezintă o reîntoarcere la un sistem descris pentru prima dată de o echipă japoneză condusă de Izumi Ishio (1). Japonezii descriu scurte secvențe palindromice de ADN despărțite de secvențe spacer non-repetitive la Escherichia coli; denumirea actuală de CRISPR, abreviere de la „clusteres regularly interspaced short palindromic repeats“, îi aparține lui Ruud Jansen încă din 2002 (2).
     În 2007, Rodolphe Barrangou (3) arăta că CRISPR, prin asociere cu proteinele Cas, conferă imunitate bacteriilor împotriva virusurilor prin compararea ADN-ului încorporat în secvențele spacer cu ADN-ul viral. Secvențele repetitive de ADN împreună cu proteinele Cas asociate și moleculele de ARN au fost denumite sistemul CRISPR/Cas.
     Sistemul CRISPR/Cas are un rol important în imunitatea bacteriană. În momentul în care o bacterie întâlnește o sursă de ADN, care poate fi un virus, aceasta poate incorpora și copia segmente din ADN-ul viral în propriul genom ca spaceri între secvențele palindromice din CRISPR. Acești spaceri stimulează imunitatea bacteriană pentru că reprezintă secvențele template pentru moleculele de ARN care vor identifica rapid aceeași secvență de ADN în eventualitatea în care va fi infectată cu același virus. Atunci când moleculele de ARN recunosc o secvență de ADN, acestea ghidează complexul CRISPR/Cas către acea secvență. Proteinele Cas bacteriene – a nu se confunda cu sistemul de caspaze specializate în tăierea ADN-ului – distrug genele virale. În 2012, Jennifer Doudna și Emmanuelle Charpentier au prezentat un sistem CRISPR/Cas9 cu un ARN hibrid care putea fi programat pentru a identifica, tăia și chiar înlocui orice secvență genică (4). Din 2012, numărul de articole în care este citată tehnica CRISPR/Cas9 a crescut exponențial (figura).
Numărul de citări ale metodei CRISPR în perioada 2003 – iulie 2016
Sursa: PubMed

 
     De ce este CRISPR/Cas atât de special? Principalul avantaj al sistemului, spre deosebire de celelalte metode de editare genomică, precum cea a nucleazelor cu domenii de zinc sau TALENs („Transcription activator-like effector nucleases“), este simplitatea în utilizare. Ambele sisteme menționate necesită ca în prealabil să fie create proteinele pentru fiecare dintre genele vizate, o etapă consumatoare de timp.
     CRISPR/Cas9 poate fi utilizat în orice tip de celule, până acum în literatură fiind menționate celule de șoarece, maimuță, broască, dar și celule stem umane sau celule ale sistemului imun. Încă din 2013 s-a testat capacitatea de adaptare a CRISPR/Cas în editarea genomului uman. Cong (5) a arătat că acest sistem poate fi transfectat în celule sub formă de plasmide care să includă un promoter adecvat pentru a promova expresia celulară și că aceste componente se pot asambla în celulele transfectate. De asemenea, s-a demonstrat că CRISPR poate să modifice eficient genomul țintit, atât în cazul locusurilor endogene, cât și la nivel de gene reporter (gene adăugate pentru detectare, identificare sau selecție) prin recombinare omoloagă sau non-omoloagă. Același grup a arătat că se pot muta două gene simultan și că eficiența de modificare a genomului este mai mare comparativ cu TALENs.
     Cas9 creează o discontinuitate în molecula de ADN dublu catenar acolo unde nu există legătură fosfodiesterazică, mai degrabă decât o fragmentare. Avantajul discontinuității față de fragmentare este că permite repararea mutației cu o frecvență mai mare prin recombinare omoloagă. Minimizarea recombinării non-omoloage în favoarea celei omoloage crește siguranța metodei și o face mai fezabilă pentru terapia genică.
     Problema care se pune atunci când se vorbește despre un sistem bazat de nucleaze este afectarea unor gene care nu sunt ținta terapiei, pentru că mutațiile punctiforme sau rearanjamentele cromozomiale pot să predispună o celulă la transformare malignă. Specificitatea CRISPR se pare că nu este determinată de întreaga sa secvență, ci de o regiune de 12–14 perechi de baze, ceea ce înseamnă că, odată ce regiunea genomică ce trebuie să fie recunoscută de CRISPR este mai scurtă, probabilitatea apariției de mutații în regiuni nedorite este mai mare. Elucidarea modalității în care un sistem proka­riot reacționează în momentul în care este introdus în cel al mamiferelor este esențială pentru a anticipa modul în care vor fi țintite unele locusuri genetice.
     Între 2012 și 2016 au fost explorate diferite aplicații ale metodei, de la identificarea genelor cu potențial în oncogeneză (6) la eradicarea infecției latente HIV-1 (7) și, cel mai recent și controversat, la modificarea genomului uman. În aprilie 2015, echipa condusă de Huang (8) a injectat sistemul CRISPR/Cas9 la embrioni umani, plecând de la ideea că, dacă se înlocuiește o genă în embrionul uman cu o singură celulă, atunci, în principiu, toate celulele rezultate din embrion o să conțină noua genă. Embrionii utilizați de aceștia au fost obținuți de la o clinică de fertilizare și aveau un set suplimentar de cromozomi, prin fertilizarea lor de către doi spermatozoizi. Au fost urmărite genele HBB, care codifică β-globulina și care prin mutații duc la β-talasemie. 86 de embrioni au fost injectați și s-a așteptat 48 de ore pentru a permite CRISPR/Cas9 să înlocuiască gena și pentru ca embrionul să ajungă la stadiul de opt celule. Din cei 71 de embrioni care au supraviețuit, 54 au fost testați genetic și numai 28 dintre ei au avut gena deletată, iar înlocuirea genei anormale cu cea normală a fost înregistrată la și mai puțini embrioni. Drept urmare, echipa chineză a întrerupt cercetarea spunând că este încă prematur pentru ca aceasta să fie utilizată la embrionii umani. Mai mult decât atât, s-a observat că numărul de mutații în zone nevizate a fost mult mai mare comparativ cu studiile făcute pe embrioni de șoarece sau pe celule umane mature.
     Deși frecvent criticată această inițiativă, revista Nature a refuzat articolul pe motive etice, pentru ca în final studiul să apară în Protein & Cell. Huang și-a justificat cercetarea și articolul susținând că este mai bine să se cunoască efectele CRISPR pe embrioni umani din studii propriu-zise decât din supoziții. Aceeași echipă lucrează la îmbunătățirea tehnicii prin introducerea enzimelor sub o formă diferită pentru a le inactiva înainte ca mutațiile să se acumuleze și prin optimizarea enzimelor pentru a le ghida mai exact în locusul dorit.
Bibliografie

1. Yoshida KI et al. Organization and transcription of the myo-inositol operon, iol, of Bacillus subtilis. J Bacteriol. 1997 Jul;179(14):4591-8

2. Jansen R et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 2002 Mar;43(6):1565-75

3. Barrangou R et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007 Mar 23;315(5819):1709-12

4. Jinek M et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21

5. Cong L et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23

6. Chen S et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015 Mar 12;160(6):1246-60

7. Hu W et al. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Aug 5;111(31):11461-6

8. Liang P et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015 May;6(5):363-72

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
  • Tipărit + digital – 200 de lei
  • Digital – 129 lei
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
  • Colegiul Medicilor Stomatologi din România – 5 ore de EMC
  • Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
  • OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
  • OAMGMAMR – 5 ore de EMC
Află mai multe informații despre oferta de abonare.