Autentificare
Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta
Căutare:
Căutare:
Acasă

Pasajul celulelor din culturi

Viața Medicală
Dr. Nicoleta-Monica FOTEA marţi, 17 ianuarie 2017
    Subcultura, denumită mai frecvent pasajul celulelor, constă în eliminarea mediului din care s-au epuizat substanțele nutritive și transferul acestora pe un alt mediu de cultură proaspăt, procedură ce permite propagarea celulelor sau a liniilor celulare. O cultură celulară trece prin mai multe faze ce descriu curba de creștere ideală a celulelor în cultură; etapa inițială este faza de lag, imediat după însămânțare, urmată de faza logaritmică, în care celulele proliferează exponențial. Atunci când celulele aderente ocupă tot substratul disponibil sau, în cazul celulelor în suspensie, este epuizat mediul de creștere, ritmul de proliferare se reduce, menținându-se constant (faza de platou), sau încetează complet (faza de declin rapid). Pentru a se menține creșterea optimă și a se stimula în continuare proliferarea, se realizează pasajul celulelor.
   Determinarea momentului în care se realizează subcultura se bazează pe aceleași criterii, atât în cazul celulelor aderente, cât și în cazul celor în suspensie. Există însă importante deosebiri între culturile celulelor de mamifere și de insecte.

 

Densitatea celulară

 

    Celulele mamiferelor. Culturile aderente trebuie pasate când se află în faza logaritmică, înainte de a ajunge la confluență. Celulele normale se opresc din creștere în momentul în care ating confluența, proces numit inhibiție de contact. Dacă se pasează în momentul în care se atinge confluența, celulele vor crește mai lent și își pot modifica unele caracteristici fenotipice și genotipice. În mod similar, și celulele în suspensie trebuie pasate în faza logaritmică pentru că în mod contrar acestea se adună în clustere.
   Celulele insectelor. Culturile ce folosesc celule de insecte (de exemplu culturile deDrosophila S2), folosite cel mai frecvent pentru expresia proteinelor heterologe (expresia heterologă se referă la expresia unor gene într-un organism gazdă ce nu exprimă în mod normal aceste gene), se pasează, de asemenea, în faza logaritmică.

 

Consumarea mediului de cultură

 

    Scăderea pH-ului indică creșterea concentrației de acid lactic, toxic și suboptim pentru creșterea celulară. Schimbarea de pH este dependentă de densitatea celulară; o scădere rapidă peste 0,1–0,2 unități de pH simultan cu creșterea densității celulare indică necesitatea pasajului. Spre deosebire de mamifere, celulele insectelor se cultivă într-un mediu mai acid. Scăderea pH-ului este graduală la celulele insectelor odată cu creșterea celulară.
   Pasarea celulelor conform unei scheme bine stabilite asigură un comportament reproductibil și permite urmărirea statusului culturii. Densitatea de însămânțare se variază până la obținerea unei rate de creștere optime pentru tipul de celule folosit. Devierea de la pattern-ul de creștere indică probleme precum: contaminare, temperatură suboptimală sau mediu de cultură inadecvat. Se recomandă respectarea programului de pasaj, a mediului de cultură, a procedurii de disociere, a ratei de split (densitatea de însămânțare la pasaj) și a concentrației de însămânțare.
   Primul pas pentru pasarea celulelor aderente la mediu este detașarea lor de pe suprafața de cultură prin metode enzimatice sau mecanice. Printre metodele mecanice de disociere se numără: agitarea plăcilor de cultură sau pipetarea viguroasă (utilizată pentru celulele ce nu aderă ferm la substrat sau pentru celulele mitotice), răzuirea (pentru celulele sensibile la proteaze, cu mențiunea că uneori acest tip de detașare poate afecta celulele). În cazul metodelor enzimatice, cele mai frecvent utilizate enzime sunt: tripsina, tripsina + colagenoza, dispaza – pentru celulele epiteliale, permițând detașarea în straturi, sau alte enzime utilizate în situații speciale (celule foarte aderente, culturi cu reactivi fără proveniență animală).

 

Pasarea culturilor aderente

 

    Pasarea unei culturi de celule aderente urmează în general următorii pași, cu modificările specifice tipului de celule utilizate (1):
   1. Înlăturarea mediului din recipientul de cultură.
   2. Spălarea celulelor cu soluție salină (frecvent utilizat este PBS). Adăugarea acesteia se face delicat, pe un perete al recipientului, pentru a nu afecta stratul de celule atașate, și apoi se distribuie pe toată suprafața prin înclinare de câteva ori. Această etapă înlătură urmele de ser, calciu sau magneziu care ar inhiba acțiunea agentului de disociere.
   3. Înlăturarea soluției de spălare.
   4. Adăugarea agentului de disociere, cel mai frecvent tripsină preîncălzită, pe un perete al vasului de cultură; se adaugă cantitatea de agent necesară pentru acoperirea stratului de celulele (această cantitate depinde de suprafața vasului de cultură).
  5. Incubarea pentru aproximativ două minute la 21°C. Perioada de incubare variază în funcție de tipul celular utilizat și trebuie verificată în tabele standardizate.
   6. Examinarea la microscop a celulelor după detașare. Dacă se detașează mai puțin de 90% din celule, se mărește timpul de incubare cu câteva minute, verificându-se disocierea la fiecare 30 de secunde. Procesul poate fi accelerat și prin agitarea recipientului.
   7. Când mai mult de 90% din celule sunt detașate, se adaugă un volum de mediu de cultură de două ori mai mare comparativ cu volumul utilizat pentru disociere. Se pipetează de câteva ori pentru a se dispersa mediul pe întreaga suprafață.
   8. Se transferă celulele într-un tub și se centrifughează. Viteza și timpul de centrifugare diferă în funcție de tipul celular. În ceea ce privește viteza de centrifugare, este bine de menționat că aceasta trebuie să fie specificată în g (forță gravitațională) și nu în rpm (rotații pe minut), întrucât forța aplicată este dependentă de diametrul centrifugei – cu cât raza este mai mare, cu atât g crește.
  9. Resuspendarea celulelor într-un volum minim de mediu de cultură încălzit și recoltarea unui volum pentru numărarea celulelor.
  10. Determinarea numărului total de celule și a procentului de viabilitate utilizând sisteme automate sau numărarea manuală.
  11. Diluarea suspensiei de celule pentru a obține densitatea recomandată la însămânțare, pipetarea volumului calculat în noi recipiente de cultură și incubarea lor.

 

Pasarea culturilor în suspensie

 

    Pasarea celulelor aflate în suspensie este mai puțin complicată decât pasarea celulelor aderente. Întrucât celulele se află deja suspendate în mediul de cultură, nu este necesară tratarea lor enzimatică pentru detașare de pe suprafața plăcilor sau flask-urilor. Pasajul se realizează direct prin diluarea celulelor sau prin înlăturarea unei părți din aceste celule și aducerea celor rămase la densitatea dorită. Frecvent, faza de lag ce urmează pasajului este mai scurtă decât cea observată la celulele aderente.

 

Alegerea mediului de cultură

 

    Alegerea mediului de cultură este un element important pentru obținerea unei culturi optime. Atunci când o cultură nu se dezvoltă conform graficului ideal de creștere, substratul și/sau mediul reprezintă primele două cauze investigate. Alegerea mediului de cultură optim pornește de la studiile anterioare pe tipul de celule utilizate. Însă o atenție deosebită trebuie acordată acestor surse pentru că s-a observat o tendință a cercetătorilor de a folosi mediile de cultură și metodele de preparare ale colegilor de laborator, dar citarea în articole a metodelor princeps publicate anterior mai degrabă decât a celor folosite (2).
   Componentele mediului sunt la fel de importante. Se recomandă utilizarea apei lipsită de endotoxine sau metale care pot afecta creșterea celulelor. După adăugarea componentelor, mediul este echilibrat prin adăugarea de NaHCO3 până la obținerea unui pH optim. Este utilă și determinarea osmolarității, pentru că eventuale erori pot fi depistate în această etapă prin modificarea acesteia.
   Alte abateri apar prin absența unui nivel optim de CO2 generat de sistemul tampon bazat pe bicarbonat. Acesta modifică pH-ul, care afectează atașarea și creșterea. Cu cât cantitatea de NaHCO3 este mai mare, cu atât nivelul de CO2 trebuie să fie mai ridicat. Cel mai cunoscut mediu tampon este EBSS, cu 2,2 g/l NaHCO3, creat pentru recipiente deschise care permit schimbul de gaze, precum plăci, flask-uri cu un capac lax (1). Al doilea sistem tampon frecvent utilizat este HBS, ce conține 0,35 g/l NaHCO3. Acesta a fost creat pentru sisteme închise de cultură. Uneori, în medii se adaugă și alte substanțe, precum HEPES, pentru că mențin mai bine pH-ul în ciuda variațiilor de CO2, cu toate că s-a evidențiat o toxicitate a acestuia în culturi după expunerea la lumină ambientală prin producerea de peroxid de hidrogen.

 

 
Bibliografie

1. Helgason CD, Miller CL. Basic Cell Culture Protocols. Humana Press, 2005

2. Burke CN, Croxall G. Variation in composition of media and reagents used in the preparation of cell cultures from human and other animal tissues: Dulbecco’s, Earle’s, and Hanks’ balanced salt solutions. In Vitro. 1983;19(9):693-8

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
  • Tipărit + digital – 200 de lei
  • Digital – 129 lei
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
  • Colegiul Medicilor Stomatologi din România – 5 ore de EMC
  • Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
  • OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
  • OAMGMAMR – 5 ore de EMC
Află mai multe informații despre oferta de abonare.